ỨNG DỤNG PCR TRỰC TIẾP TRONG NGHIÊN CỨU

1. Giới thiệu:

Kỹ thuật PCR là sự mô phỏng quá trình nhân gene diễn ra trong tế bào, dưới tác dụng của enzyme xúc tác. Do đó nói cách khác, môi trường tế bào cũng phù hợp với PCR. Ngày nay, với tiến bộ khoa học kỹ thuật, các enzyme và sinh phẩm cho PCR ngày càng đặc hiệu, đề kháng tốt với chất ức chế, hiệu suất cao và có khả năng đọc sửa.

Trên thực tế, những nhà nghiên cứu thực hiện kỹ thuật tái tổ hợp, biến nạp, tách dòng gene với plasmid và E.coli thường chấm một đầu que tăm nhọn lên khuẩn lạc và chuyển vào ống PCR, sau đó chạy phản ứng trực tiếp.

Trong nghiên cứu, nhu cầu phát hiện, đánh giá hệ gene của các quần thể nhỏ, các đột biến thể khảm, gene nhảy, các dòng tế bào có tiềm năng sản xuất cao… đòi hỏi cần PCR và phân tích gene tới từng tế bào đơn độc. Ứng dụng PCR trực tiếp từ tế bào có thể đáp ứng tính toàn vẹn, và đại diện từ những cá thể, quần thể nhỏ tế bào cần quan tâm.

2. Ứng dụng PCR trực tiếp từ tế bào không qua xử lý

Việc ứng dụng này phù hợp với các dòng vi khuẩn, vi nấm, vi tảo, dòng tế bào tách từ động / thực vật. Các nhà nghiên cứu có thể chỉ ra chính xác các dòng có tiềm năng sản xuất, đề kháng bệnh, hoặc có ưu thế đặc biệt nào đó, mà không cần sử dụng lượng lớn để tách chiết ADN. Với lượng tế bào thuần đã biết, nhà nghiên cứu có thể pha loãng tới nồng độ 01 tế bào hay quần thể tế bào nhỏ cho mỗi phản ứng, chuyển trực tiếp vào ống PCR để tiến hành. Việc pha loãng tới hạn này cũng góp phần giảm thiểu các chất ức chế tiềm năng có trong dung dịch nuôi cấy. Phản ứng PCR luôn có giai đoạn bắt đầu bằng 94-98 0C, do đó tế bào ngay lập tức được biến tính và giải phóng ra ADN cho phản ứng. Như chúng ta đã biết, PCR cơ bản gồm 3 giai đoạn là biến tính, gắn mồi, kéo dài chuỗi. Trong đó thường các nhà nghiên cứu hay chú ý tới giai đoạn gắn mồi, với các điều chỉnh nhiệt độ đảm bảo độ nhạy và độ đặc hiệu. Tuy nhiên bước biến tính 94-98 0C có một vai trò chính yếu cần lưu tâm là: giãnmạch ADN, chuyển từ cấu hình liên kết không gian giữa các ADN với nhau, và với các protein, peptide, lipid còn tồn dư. Và vai trò này đóng luôn nhiệm vụ ly giải ADN từ nhân tế bào trong PCR trực tiếp, kèm theo tiêu hủy ribosome RNA, mRNA vốn kém bền nhiệt. Ngoài ra hiện nay các enzym cho PCR đều ở chế độ hot-start, do đó khi chưa có bước này, thì phản ứng hoàn toàn chưa diễn ra, đảm bảo duy trì độ đặc hiệu của phản ứng.

3. Ứng dụng PCR với các mẫu, tế bào xử lý đơn giản

Việc ứng dụng này thường được tiến hành với các mẫu mô có tính chất thô, nhưng thuần nhất ví dụ như tai hay đuôi chuột, móng hay chân lông, chồi mầm nuôi cấy mô thực vật. Có hai phương pháp là xử lý không có chất biến tính, và có bổ sung chất biến tính.
Xử lý không bổ sung chất biến tính: mẫu mô được cắt nhỏ, ngâm trong nước tinh khiết cho sinh học phân tử, hoặc dung dịch đệm như TE. Sau đó tiến hành biến tính bằng nhiệt 94-980C trong 15-30 phút, làm lạnh nhanh bằng đá bào hoặc 40C trong 15-20 phút, tiến hành ly tâm để lắng cặn và dùng dịch nổi cho PCR.

Xử lý có bổ sung chất biến tính: thường áp dụng với mẫu như sụn tai hay đuôi chuột, mẫu móng, cặn tế bào sau ly tâm. Mẫu được cắt nhỏ, ngâm trong dung dịch NaOH, và tiến hành biến tính 94-980C trong 15 phút, sau đó trung hòa pH bằng dung dịch đệm như TAE, làm lạnh và ly tâm. Các nhà nghiên cứu cũng có thể sử dụng proteinase K thay cho NaOH, ủ ở 37-550C trong 30 phút trở lên, sau đó biến nhiệt 94-980C trong 15-30 phút, làm lạnh và ly tâm. Cách này không cần sử dụng dung dịch trung hòa pH nhưng có thể gia tăng chi phí.

4. Kiểm soát chất lượng PCR

Khi ứng dụng kỹ thuật này, các nhà nghiên cứu có thể nghi ngờ về chất lượng ADN, hoặc các chất ức chế. Trên thực tế, việc đo nồng độ ADN, hay đánh giá tạp chất với phương pháp này không khả thi.
Cách tiếp cận tối ưu ở đây là sử dụng kèm PCR gene nội chứng thường là house-keeping gene:
Vi khuẩn: recA, gyrA, rpoD, proC, gmk, rho, 16S, ftsz, secA
Vi nấm: ACT1, EF1, GAPDH, PGK1, RDN5.8, RDN18
Vi tảo và thực vật: GAPDH , 30S, 18S& 25S rRNA
Tế bào động vật: β-actin, GAPDH, RPL13A & RPL32 (60S ribosomal subunit)
Việc chạy kèm một phản ứng nội kiểm với house-keeping gene không chỉ đánh giá đúng khả năng sử dụng của mẫu, mà còn kiểm soát chất lượng của bộ sinh phẩm, loại trừ âm tính giả.

5. Các vật tư tiêu hao cần thiết cho PCR

Hình minh hoạ. Nghiên cứu PCR
Để phục vụ tốt cho nghiên cứu lĩnh vực sinh học phân tử nói chung và PCR nói riêng, TSI Hà Nội luôn sẵn sàng cung cấp các vật tư phục vụ PCR chất lượng cao mang thương hiệu Sarstedt với xuất xứ Đức. Tất cả các sản phẩm đều được chứng nhận ‘Kiểm tra hiệu suất PCR’ và đảm bảo không chứa DNA, không có DNase / RNase và không chứa chất ức chế PCR. Các vật tư chính bao gồm:
– Ống PCR, chuỗi 4 ống PCR, chuỗi 8 ống PCR,
– Khay PCR,
– Ống ly tâm – ống falcon 15ml, 50 ml
– Đầu côn đa dạng thể tích: 10ul- 1250ul,
– Ống eppendorf 0.5ml; 1ml; 1.5ml; 2ml,
– Khay lạnh PCR,
Và nhiều vật tư liên quan khác, chi tiết xem tại: Vật tư tiêu hao cho PCR và sinh học phân tử